Блог

Jun 28, 2023

Визуализация неисправной ядерной транспортной техники на месте

Nature Volume 617, страницы 162–169 (2023) Цитировать эту статью 18k Доступов 3 Цитирования 214 Подробности об альтметрических метриках Комплекс ядерных пор млекопитающих (NPC) с массой около 120 МДа действует как привратник для

Nature, том 617, страницы 162–169 (2023 г.) Процитировать эту статью

18 тысяч доступов

3 цитаты

214 Альтметрика

Подробности о метриках

Комплекс ядерных пор (NPC) млекопитающих массой около 120 МДа действует как привратник для транспорта между ядром и цитозолем1. Центральный канал NPC заполнен сотнями внутренне неупорядоченных белков (IDP), называемых FG-нуклеопоринами (FG-NUP)2,3. Хотя структура каркаса NPC была решена в мельчайших подробностях, реальная транспортная машина, построенная с помощью FG-NUP (около 50 МДа), изображается как отверстие размером примерно 60 нм даже на томограммах и/или структурах с высоким разрешением, рассчитанных с помощью искусственных материалов. интеллект4,5,6,7,8,9,10,11. Здесь мы непосредственно исследовали конформации жизненно важного FG-NUP98 внутри NPC в живых клетках и в пермеабилизированных клетках с неповрежденным транспортным механизмом, используя синтетический биологический подход к сайт-специфическому мечению малых молекул в сочетании с флуоресцентной микроскопией с высоким временным разрешением. Измерения распределения сегментов FG-NUP98 по расстояниям в одиночных пермеабилизированных клетках в сочетании с крупнозернистым молекулярным моделированием NPC позволили нам составить карту неизведанной молекулярной среды внутри наноразмерного транспортного канала. Мы определили, что канал обеспечивает – в терминологии теории полимеров Флори12 – среду «хорошего растворителя». Это позволяет домену FG принимать расширенные конформации и, таким образом, контролировать транспорт между ядром и цитоплазмой. Поскольку более 30% протеома формируется из IDP, наше исследование открывает окно для разрешения взаимоотношений расстройства и функций IDP in situ, которые важны в различных процессах, таких как передача клеточных сигналов, разделение фаз, старение и проникновение вируса.

IDP — это гибкие, динамичные макромолекулы, у которых отсутствует фиксированная третичная структура и которые могут принимать ряд конформаций для выполнения различных функций в клетке. ВПЛ имеют большое значение для физиологии человека и играют центральную роль, среди прочего, в нейродегенеративных заболеваниях старения и раке. IDP также являются ключевыми игроками в разделении фаз и участвуют в образовании биомолекулярных конденсатов13,14,15,16,17,18,19,20,21. В наноразмерном NPC, общая молекулярная масса которого у млекопитающих составляет около 120 МДа, присутствуют сотни IDP, обогащенных остатками фенилаланина (F) и глицина (G), известных как FG-NUPs1. FG-NUPs образуют барьер проницаемости в центральном канале NPC, который регулирует ядерно-цитоплазматический транспорт, ограничивая прохождение больших грузов, если только он не представляет последовательность ядерной локализации или последовательность ядерного экспорта2,3. Рецепторы ядерного транспорта могут специфически распознавать эти последовательности и эффективно переносить груз через барьер. Благодаря недавним достижениям в области криоэлектронной томографии, кристаллографии, протеомики и прогнозирования структуры на основе искусственного интеллекта (ИИ), приблизительно 70 МДа каркаса NPC, окружающего центральный канал, было разрешено с почти атомным разрешением4,5,6,7,8 ,9,10,11. Однако сигналы от высокодинамичных FG-NUP в целом недоступны для этих методов структурной биологии, а реальный транспортный механизм внутри центрального канала — еще примерно 50 МДа — не улавливается, оставляя дыру размером примерно 60 нм в центр каркасной конструкции. Следовательно, конформационное состояние белка внутри NPC остается неуловимым, что привело к нескольким частично противоречивым гипотезам о морфологии доменов FG в их функциональном состоянии22,23,24,25,26,27,28. Поскольку примерно 30% всего протеома эукариот внутренне неупорядочено, проблема, заключающаяся в том, что конформационное состояние нелегко изучить в клетках, выходит далеко за рамки биологии NPC. Помимо методов магнитного резонанса и рассеяния13,14, флуоресценция одиночных молекул очищенных и меченых белков стала мощным инструментом для исследования конформации белков в растворе; передовые исследования даже показали, что это возможно в клетках, если такие зонды микроинъецировать29,30,31. Однако NPC собирается только в позднем митозе и во время ядерного роста в интерфазе32, и поэтому его маркировка требует генетического кодирования. Однако признанные технологии на основе флуоресцентных белков, такие как GFP, или самомаркирующиеся белковые метки, такие как SNAP-tag33, с трудом позволяют извлекать множественные распределения расстояний для одного и того же белка из-за огромного размера флуоресцентной метки и присущей ей ограниченная свобода маркировки.